Высокопатогенный грипп птиц

Б.П. Экви, Российский ветеринарный журнал

Сокращения: ВГП — вирус гриппа птиц; КЭ — куриные эмбрионы; РГА — реакция гемагглютинации; РДП — реакция диффузионной преципитации; ПЦР — полимеразная цепная реакция

Введение

Грипп птиц впервые описал Перрончито 1878 г. Некоторое время его путали с болезнью Ньюкасла, но после установления этиологии последнюю стали называть азиатской, а грипп птиц — европейской (классической) чумой птиц. Вспышки европейской чумы птиц регулярно происходили в начале минувшего века в странах Европы, Африки и Азии. В Северную Америку болезнь попала только в 1925 г.

За последние 50 лет минувшего столетия за рубежом зарегистрировали 18 наиболее крупных эпизоотий этого заболевания: 5 произошло в Великобриатнии, 5 в Австралии, 3 в других странах Европы, и по одной в Пакистане, Гонконге, Канаде, США и Мексике [2]. Не обошла стороной европейская чума птиц и нашу страну — особенно большой ущерб она нанесла: птицеводству центральных районов России в 60…70-х годах минувшего столетия.

В новом милениуме болезнь стала одной из основных причин беспокойства ветеринарных и медицинских специалистов всего мира. В 2002 г. ее впервые зарегистрировали в Южной Америке. Эпизоотия, начавшаяся на следующий год в Юго-Восточной Азии, отличается от предыдущих участившимися случаями заболевания и смерти людей, продолжительностью и масштабами, грозящими ее переходом в пандемию.

В данной публикации обсудим лишь некоторые особенности биологии ВГП, которые могут объяснить причины происходящего, а также остановимся на аспектах практического плана, важных для правильной диагностики и предотвращения широкого распространения заболевания. Возбудитель

Вирусы гриппа — агенты с одноцепочечной РНК, входящие в сем. Orthomyxoviridae. Их делят на 3 рода: A,B и C. У птицы в полевых условиях инфекцию вызывает ВГП, входящий в состав рода А. Генетический анализ показал, что ВГП был прародителем исчезнувшего 15 лет тому назад и современного вирусов гриппа лошадей, вируса гриппа свиней и вируса гриппа человека [4].

О степени родства штаммов ВГП судят по поверхностным гликопротеинам — гемагглютинину (Н) и нейраминидазе (N). Выделенные за обозримый период времени от домашних и диких пернатых штаммы ВГП относились к подтипам, обладающим комбинацией 15 вариантов H(H1…H15) и 9 вариантов N (N1…N9). При одновременной инфекции несколькими подтипами ВГП между их нуклеиновыми кислотами возможен обмен сегментами (в нуклеиновой кислоте вируса их 8). Поэтому гипотетически (с учетом числа вариантов Н и N) возможно 256 модификаций возбудителя, различающихся по генотипу и фенотипу.

Многие подтипы ВГП (их называют слабопатогенными) широко распространены, но их инфекция протекает бессимптомно или в легкой форме. Встреча восприимчивой птицы с высокопатогенными подтипами ВГП (в настоящее время их известно 2 — H5 и H7) значительно опаснее — инфекция может принять генерализованную форму и завершиться летальным исходом. Но далеко не все штаммы ВГП, имеющие антигены H5 или H7, высокопатогенны для домашней птицы.

Грань между слабопатогенными и высокопатогенными штаммами ВГП крайне тонка. Прекрасной иллюстрацией этому служит вспышка птичьего гриппа в Чили (2002 г.), вызванная высоковирулентным штаммом подтипа H7N3. Он эволюционировал из слабопатогенных штаммов ВГП того же подтипа, широко распространенных в Южной Америке, но ранее никогда не вызывавших у птицы симптомов гриппа [9].

В последние годы вспышки высокопатогенного гриппа птиц на Американском континенте (США, 2004 г.), в Пакистане (2004 г) и Нидерландах (2004 г.) вызвал подтип Н7, а в Юго-восточной Азии и других странах Европы — подтип Н5. Подтип H5N1, получивший в настоящее время наиболее широкое распространение, появился, по всей видимости, в Гонконге в 1997 г. Затем он проник в Южную Корею, Китай, Вьетнам, Японию, Таиланд, Камбоджу, Лаос, Индонезию, Малазию и Филиппины, а затем перелетные птицы занесли его в Монголию, Казахстан, Россию, Турцию, Грецию, Хорватию и Кувейт.

Специфические природно-климатические и социально-экономические условия Юго-восточной Азии сделали этот регион «генетическим котлом», в котором периодически возникают опасные варианты ВГП. Например, в Таиланде в последние годы от заболевшей птицы изолировали не только подтип H5N1, но и H5N2.

Устойчивость

ВГП способен длительно сохраняться в фекалиях и тушках птицы, особенно при низкой температуре: при 60 °C— в течение нескольких лет, при 4 °C — несколько недель. В зависимости от субстрата, в котором находится вирус, он инактивируется при температуре 56°Cза 1…3ч., при 60°Cза 10…30мин, при 70°Cза 2…5мин. На ВГП губительно действуют кислая pH, формалин, додецилсульфат натрия, растворители жиров, ?-пропиолактон, препараты йода, широко применяемые средства дезинфекции (хлорная известь, креолин, карболовая кислота и др.). Резервуар инфекции

Важнейшую часть природного резервуара ВГП составляют дикие водоплавающие птицы. Их сезонные миграции и относительно высокая устойчивость к возбудителю создают условия для широкого распространения инфекции. Филогенетический анализ изолятов ВГП, выделенных от диких птиц в разных уголках планеты, выявил удивительный факт: возбудитель в этом резервуаре на протяжении длительного периода времени не претерпевает существенных генетических изменений. С одной стороны это радует, поскольку было бы значительно хуже, если в стадах диких птиц регулярно появлялись новые высокопатогенные варианты возбудителя. Но в такой экологии инфекции кроется опасная ловушка — дикие птицы могут сохранять многие опасные штаммы ВГП в состоянии генетического стаза на протяжении неопределенно длительного времени. Эти «мины замедленного типа» могут «взорваться» в любой момент.

Из домашней птицы к ВГП наиболее восприимчивы курица и индейка, в меньшей степени, фазан, перепелка, утка, гусь, цесарка, павлин и страус.

ВГП способен преодолевать межвидовые барьеры. От свиней выделяли его подтипы H1N1, H1N7, H3N2, H5N1, от лошадей H3N8, от норок H10N4, от тигра, леопарда и домашней кошки H5N1, от тюленей H7N7, H4N5, H4N6 и H3N3, от китов H13N2, H13N9 и от людей H1N1, H2N2, H3N2, H3N8, H5N1, H7N3, H7N7. Роль большинства перечисленных видов млекопитающих в эпизоотологии гриппа птиц не изучена. Говоря о зооантропонозном потенциале ВГП, следует в первую очередь вспомнить испанку, вызванную подтипом H1N1: в 1919 г. она унесла жизнь у 40…50 млн. людей. Жертвы распространяющегося в настоящее время подтипа пока не столь велики — в Юго-восточной Азии и Турции он вызвал заболевание нескольких сотен человек, из которых умерло около 80. Очевидно, циркулирующие штаммы H5N1пока не приспособились к распространению от человека к человеку. Если это произойдет, то велика вероятность возникновения пандемии, последствия которой трудно предсказать. Пути заражения

Птицы заражаются ВГП при непосредственном контакте с источником инфекции, а также через контаминированные слюной, назальным секретом и фекалиями последнего объекты внешней среды (чаще всего воду). Как показывает опыт стран Азии, к контаминации возбудителем водоемов ведет не только пребывание на них инфицированных птиц, но также кормление птичьим навозом выращиваемой рыбы.

ВГП может механически распространяться, длительно сохраняясь на одежде персонала, оборудовании, в транспортных средствах и т.д. Попав на благополучную птицеферму, инфекция начинает быстро распространяться.

У людей случаев передачи подтипа H5N1, как это имело место с подтипом H1N1, не зарегистрировано. Однако у кошек H5N1 может передаваться горизонтальным путем [7].

Сезонность

Поскольку основным резервуаром ВГП служат перелетные птицы, то вспышки гриппа в птицеводческих хозяйствах обычно происходят во время сезонных миграций пернатых — весной и осенью. Симптоматика

Инкубационный период составляет 1…4 дня. Высокопатогенные штаммы ВГП, в отличие от слабопатогенных, инфекция которых обычно протекает бессимптомно или в легкой клинической форме, вызывают у восприимчивой птицы острую форму болезни. Наблюдают также молниеносном течении инфекции, когда птица погибает без предшествующего переболевания.

Острая форма гриппа сопровождается разнообразными клиническими проявлениями системной инфекции, сопровождающейся поражением органов пищеварения, дыхания, репродукции, а также нервной системы. У больной птицы проявляются вариабельные сочетания следующих симптомов: угнетения, сонливости, снижения аппетита, кашля, хрипов, чихания, обильного слезотечения, диареи, тремора, нарушения координации движений, цианоза непокрытых перьями участков кожи (особенно гребешка и сережек), отека головы, взъерошенности перьевого покрова, диареи, снижения яйценоскости и качества скорлупы яиц. Летальный исход наступает в течение 1…2сут после появления первых симптомов. Падеж птицы от высокопатогенного гриппа может достигать 90…100%. Патоморфология

Патоморфологическая картина при гриппе птицы также вариабельна, как и симптоматика, которой она во многом соответствует. При вскрытии павшей птицы отмечают отек мышц, подкожных тканей, области головы и шеи, скопление слизистых выделений в просвете трахеи, носовой и ротовой полостях, конъюнктивит, синусит, аэросаккулит, ларинготрахеит, интерстициальную пневмонию, энтерит, нефрит, кровоизлияния (на серозных покровах, слизистой оболочке преджелудков и кишечника, в нутряном жире, яичниках, лимфоидных тканях, тканях грудины), скопление кровянистой жидкости в брюшной полости.

При гистологическом исследовании в таких случаях чаще всего выявляют некротические изменения печени, селезенки, головного мозга, поджелудочной железы, лимфоидных тканей кишечника, бронхит, дегенерацию мышечного слоя клоаки, катаральное поражение пищеварительного тракта.

Иммуногистохимическими методами обнаруживают антиген ВГП в печени, селезенке, сердце, кишечнике, преджелудках, яйцепроводах, головном мозге, почках, поджелудочной железе, легких и трахее. Вирусный антиген локализуется преимущественно в эндотелии капилляров и паренхиматозных клетках [6]. Диагностика

Неспецифичность и вариабельность симптоматики и патоморфологических изменений у птицы при гриппе выдвигают на первый план при постановке диагноза вирусологическое исследование (это совсем не означает, что следует пренебрегать результатами клинического и патоморфологического исследований, а также данными эпизоотологического анализа).

При жизни от птицы для вирусологического исследования берут пробы фекалий, смывы со слизистых оболочек (клоаки, конъюнктивы, носа), выделения из глаз и носа, а от трупов — пораженные органы (трахею, легкие, кишечник, селезенку, почки, печень, головной мозг и сердце). Патологическим материалом заражают 8…11-дневных КЭ (по 5 на 1 пробу) в аллантоисную или амниотическую полости. Фильтрование и осветление центрифугированием суспензии патологического материала снижают риск гибели КЭ от посторонних причин и появление в них неспецифических гемагглютининов. Для ускорения экспертизы уже через сутки после инокуляции патологического материала можно собирать пробы аллантоисной жидкости для тестирования в реакции гемагглютинации. Однако более надежные результаты получают при исследовании погибших КЭ (различные штаммы ВГП вызывают такой эффект в течение 1…7 дней, что и определяет продолжительность периода инкубации КЭ). В конце этого срока аллантоисную жидкость повторно исследуют в РГА, а суспензию хорионаллантоисных оболочек после 3-кратного цикла замораживания-размораживания, осветления центрифугированием и обработки формалином или ?-пропиолактоном — в РДП. Эти реакции, проводимые с референтными антисыворотками к разным подтипам ВГП, служат надежными средствами идентификации возбудителя. В последние годы с той же целью стали применять иммуноферментный анализ.

ВОЗ рекомендует пользоваться для экспресс-диагностики гриппа птиц перевиваемыми линиями клеток HeP-2, RDи MDCK[1]. С помощью иммуноферментного анализа и реакции иммунофлюоресценции, а также ПЦР удается диагностировать инфекцию ВГП в течение 1..2 суток после внесения патологического материала в культуры клеток. В более поздние сроки для этого применяют РГА.

Иммуноферментный анализ и ПЦР все шире применяют для тестирования патологического материала, взятого от птицы, подозреваемой в заражении ВГП.

После изоляции и идентификации ВГП важно определить является ли данный штамм слабо- или высоковирулентным. Традиционно с этой целью 4…8-недельным цыплятам внутривенно инокулируют аллантоисную жидкость зараженных агентом КЭ. За птицами ведут наблюдение в течение 10 дней. Если из 8 зараженных цыплят погибло не менее 6, то штамм ВГП считают высокопатогенным. Другим критерием этого служит индекс патогенности, который должен быть не менее 1,2 (этот показатель рассчитывают на основании оценки клинического состояния и случаев гибели цыплят, использованных для постановки биопробы).

Определение аминокислотного состава одного из участков молекулы гемагглютинина открывает еще большие возможности для оценки патогенности выделенных изолятов ВГП.

Следует отметить, что 2 подтипа ВПГ (H10N4 и H10N5), которые не вызывают заболевания или гибели птицы после интраназального заражения и не имеют характерной для высокопатогеннных подтипов ВГП аминокислотной последовательности гемагглютинина, после внутривенного введения убивают практически всех цыплят и имеют индекс патогенности выше 1,2. Причины данного феномена пока не известны.

При клиническом обследовании заболевшей птицы, вскрытии трупов, взятии патологического материала и проведении лабораторных исследований следует придерживаться мер безопасности, чтобы не заразиться ВГП. Серологическая диагностика

У инфицированной ВГП птицы развивается гуморальный иммунитет. Для обнаружения в ее сыворотке крови специфических антител пользуются РДП, РГА, реакцией ингибиции гемагглютинации и иммуноферментным анализом.

В РДП выявляют матричный и нуклеокапсидный антигены ВГП — они сходны у всех подтипов вируса. Эти антигены образуют с антисыворотками наиболее четкие линии при содержании в агаровом геле 8% хлористого натрия. Результаты РДП учитывают 2 раза: через 24 и 48 ч. после внесения реагентов в лунки.

Для постановки РГА и реакции ингибиции гемагглютинации пользуются эритроцитами свободных от патогенных возбудителей цыплят. Эти тесты проводят в пластиковых планшетах при комнатной температуре или 4 С. При исследовании сыворотки крови кур очень редко отмечают неспецифическую ингибицию агглютинации эритроцитов цыплят. Поэтому сыворотку крови кур тестируют без предварительной обработки. Из-за более высокой частоты неспецифических реакций сыворотку крови других видов птицы заранее обрабатывают эритроцитами цыплят. С этой целью смесь тестируемой сыворотки и эритроцитов после перемешивания выдерживают не менее 30 мин при комнатной температуре и центрифугируют 2…5 мин при 800 g. Верхний слой сыворотки собирают для тестирования. Профилактика и контроль

Успех борьбы с гриппом птиц во многом зависит от мониторинга эпизоотической ситуации в разных регионах мира, создании на пути миграции перелетных птиц условий, снижающих риск заражения домашней птицы, в т.ч. иммунизации птицы в наиболее опасных районах. Пока нет вакцин, способных предотвратить заражение птицы всеми известными подтипами возбудителя. Однако иммунизация повышает резистентность птицы, снижая тяжесть симптоматики, интенсивность выделения возбудителя во внешнюю среду и уровень смертности.

Применение живых вакцин сопряжено с двумя проблемами — риском создания стационарных очагов инфекции в популяции привитой птицы и усложнением диагностики. В первом случае, как это произошло в Мексике [5], возрастает частота антигенных и генетических мутаций агента, что может стать причиной появления его высоковирулентных подтипов.

Инактивированные вакцины готовят из аллантоисной жидкости КЭ, зараженных ВГП. Вирус инактивируют ?-пропиолактоном или формалином. Для повышения иммуногенности в качестве адъюванта в препараты добавляют минеральное масло. Применяют 2 типа инактивированных вакцин: гомологичные (из того же подтипа ВГП, что и циркулирующие в данном регионе полевые штаммы) и гетерологичные (из штамма, сходного с циркулирующим